Новый антиген | Тяньцзиньская компания расходомеров, ООО

Nature, том 610, страницы 752–760 (2022 г.) Процитировать эту статью

33 тыс. доступов

36 цитат

145 Альтметрика

Подробности о метриках

Установление и поддержание толерантности к аутоантигенам или безобидным чужеродным антигенам жизненно важно для сохранения здоровья организма. Внутри тимуса медуллярные эпителиальные клетки тимуса (mTEC), экспрессирующие аутоиммунный регулятор (AIRE), играют решающую роль в аутотолерантности за счет удаления аутореактивных Т-клеток и стимулирования развития регуляторных Т-клеток тимуса (Treg)1,2,3,4. В течение нескольких недель после рождения на периферии возникает отдельная волна дифференцировки Treg-клеток при воздействии антигенов, полученных из пищи и комменсальной микробиоты5,6,7,8, однако типы клеток, ответственные за генерацию периферических Treg-клеток (pTreg), не выявлено. Здесь мы описываем идентификацию класса антигенпрезентирующих клеток RORγt+, называемых клетками Thetis, с транскрипционными особенностями как mTEC, так и дендритных клеток, включая четыре основные подгруппы (TC I – TC IV). Мы обнаруживаем волну развития клеток Thetis в кишечных лимфатических узлах во время критического окна в раннем возрасте, совпадающую с волной дифференцировки клеток pTreg. В то время как TC I и TC III экспрессировали характерный ядерный фактор mTEC AIRE, TC IV не экспрессировал AIRE и был обогащен молекулами, необходимыми для генерации pTreg, включая TGF-β-активирующий интегрин αvβ8. Утрата либо главного комплекса гистосовместимости класса II (MHCII), либо ITGB8 клетками Thetis привела к глубокому нарушению дифференцировки кишечного pTreg с последующим колитом. Напротив, экспрессия MHCII врожденными лимфоидными клетками RORγt+ группы 3 (ILC3) и классическими дендритными клетками не была ни достаточной, ни необходимой для генерации pTreg, что еще больше указывает на то, что TC IV является толерогенной антигенпрезентирующей клеткой RORγt+ с важной функцией в раннем возрасте. Наши исследования выявили параллельные пути установления толерантности к собственным и чужеродным антигенам в тимусе и на периферии соответственно, отмеченные участием общих клеточных и транскрипционных программ.

В тимусе отдельная линия эпителиальных клеток устанавливает толерантность к аутоантигенам посредством делеции аутореактивных Т-клеток и стимулирования дифференцировки Treg-клеток1,2,3,4. Эти функции mTECs частично опосредуются экспрессией AIRE, который регулирует эктопическую экспрессию тканеограниченных антигенов1. Еще одним важным местом индукции толерантности является лимфоидная ткань кишечника, где развивающаяся иммунная система ребенка подвергается воздействию многих новых пищевых компонентов и колонизирующих микробов после отлучения от груди. Установление гармоничных отношений между хозяином и микробиотой на этом раннем этапе развития имеет решающее значение для предотвращения более позднего возникновения иммуноопосредованных нарушений7,9. Центральное место в установлении толерантности к кишечным микробам занимает дифференцировка наивных Т-клеток в периферически генерируемые Treg (pTreg) клетки при встрече с антигенами комменсального происхождения5,6,10,11. Однако идентичность антигенпрезентирующей клетки (APC), которая способствует дифференцировке клеток pTreg, неизвестна. Узкое временное окно для установления иммунного гомеостаза кишечника предполагает наличие ограниченного в развитии толерогенного APC в кишечной нише новорожденного.

Экстратимические клетки pTreg, отличающиеся от своих тимусных аналогов экспрессией сиротского ядерного рецептора RORγt, возникают в мезентериальных лимфатических узлах (mLN) в ответ на комменсальные бактериальные антигены и играют решающую роль в подавлении воспалительных иммунных ответов против кишечных микробов6,11. И наоборот, у мышей с дефицитом презентации антигена, ограниченного MHCII, клетками RORγt+ (MHCIIΔRORγt), развивается тяжелое воспаление кишечника, поскольку у них не вырабатывается толерантность к комменсальным бактериям12, что указывает на потенциальную связь между RORγt+ APC и образованием клеток RORγt+ pTreg. Чтобы учесть эту возможность, мы проанализировали мышей MHCIIΔRORγt в возрасте трех недель, когда клетки pTreg накапливаются в кишечнике5,6. Мы наблюдали заметное снижение количества клеток RORγt+ pTreg в mLN и собственной пластинке толстой кишки, а также увеличение количества эффекторных T-клеток CD44hi (Teff) (рис. 1a-d и расширенные данные, рис. 1a). В возрасте восьми недель у этих мышей наблюдалось устойчивое и серьезное снижение количества клеток RORγt+ pTreg наряду с увеличением количества Т-хелперов 17 (TH17) толстой кишки (рис. 1e и расширенные данные, рис. 1b), что соответствует предыдущим исследованиям, демонстрирующим выраженную роль специфичных для патобионтов клеток RORγt+ pTreg в подавлении воспалительных клеток TH1711. Гистологический анализ продемонстрировал тяжелый колит с выраженным воспалительным клеточным инфильтратом, изъязвлением слизистой оболочки и потерей крипт (рис. 1f,g), подтверждая критическую роль RORγt+ APC в предотвращении нарушения регуляции кишечного иммунного ответа.

1.5, adjusted P < 0.01) for each Thetis cell cluster. h, Dot plot showing expression of selected cell-surface markers that are differentially expressed between Thetis cell subsets. i, Gating strategy for identification of Thetis cell subsets. j, Intracellular expression of AIRE protein by Thetis cell subsets; each symbol represents an individual mouse (n = 4). k, summary of TC I–TC IV phenotypes. Plots in i are representative of n = 6 mice from 3 independent experiments. Data in b,e,j are representative of 3 independent experiments. Box plots in c indicate median (centre line) and interquartile range (hinges), whiskers represent minimum and maximum values, and dots represent outliers./p>

50,000 cells (viability 95%) were lysed for 4 min and resuspended in Diluted Nuclei Buffer (10x Genomics, 2000207). Lysis efficiency and nuclei concentration was evaluated on Countess II automatic cell counter by trypan blue staining. Nuclei (9,660 per transposition reaction) were loaded, targeting recovery of 6,000 nuclei after encapsulation. After the transposition reaction, nuclei were encapsulated and barcoded. Next-generation sequencing libraries were constructed following the manufacturer’s instructions, and were sequenced on an Illumina NovaSeq 6000 system./p>

1,000 and < 50,000), the number of detected genes (>500 and < 6,000), and the fraction of mitochondrial transcripts (<15%). Barcodes were further filtered based on the number of scATAC-seq fragments (3.5 < log10(number of fragments) < 4.5) and transcription start site enrichment score (>4). Arrow files were created from the scATAC-seq fragments using ArchR v1.0.154, and doublets were identified and removed with default parameters. Finally, any genes detected in <2 cells in the scRNA-seq data were discarded, leaving 20,779 genes. After clustering, the scRNA-seq data (described in ‘Dimensionality reduction, cell clustering, and visualization’), and based on the expression of marker genes, we identified 5 minor contaminant clusters (glial cells; cluster 17, plasmacytoid dendritic cell; cluster 18, Rorc–/lo CCR7+ dendritic or Thetis cell; cluster 19, mixed monocyte/cDC1; cluster 20, and macrophage; cluster 21) which were excluded from downstream analyses. In total, 10,145 cells remained, with a median scRNA-seq library size of 3,150 and a median of 13,885 scATAC-seq fragments./p>50,000), number of detected genes (>1,300), and the fraction of mitochondrial transcripts (<8%). Finally, genes detected in <2 cells were discarded. A total of 481 cells remained, with a median library size of 924,319 from 27,195 genes./p>1.5) and adjusted P value (<0.01). Ribosomal and mitochondrial genes were removed from the final list of genes reported or visualized. Where stated, the top DEG markers were subsequently selected for each group, based on fold change./p>

1.3, adjusted P < 0.01) comparing the scRNA-seq clusters in a one-vs-rest test, that were also expressed in the microarray data. The proliferating and progenitor clusters were excluded from the differential expression test, and the LTi clusters were grouped together. For visualization of results, only cell lineages containing a cell type with > 0.25 cosine similarity with either Thetis cell or ILC3 clusters were plotted./p>

1.3, adjusted P < 0.01) identified in a one-vs-rest differential expression test for non-proliferating Thetis cell clusters (2–5), that were also expressed in the thymic epithelial cells. Among individual clusters of thymic epithelial cells defined in the original dataset, we identified 2 clusters of transit amplifying AIRE+ cells (clusters 25 and 26), distinguished by signature gene expression including cell cycle genes./p> 1.5, adjusted P < 0.01), we identified orthologous human genes that were uniquely mapped by gprofiler2 and computed enrichment scores for Thetis cell subset gene signatures for each human cell./p>0.001 of the sequence) were filtered. Regions from all groups were compiled and overlapping regions were merged to their union, resulting in a non-overlapping set of 176,942 peaks. A peak-by-cell count matrix was created by ArchR with a ‘ceiling’ value of 4 for the counts to avoid strong biases./p> 1 h at room temperature, postfixed in 1% osmium tetroxide, dehydrated in acetone, and processed for Epon embedding. Ultrathin sections (60–65 nm) were counterstained with uranyl acetate and lead citrate. Images were taken with a transmission electron microscope (Tecnai G2–12; FEI) equipped with a digital camera (AMT BioSprint29)./p>

1.5, P < 0.01). d, Expression score of cell-cycle genes for each scRNA-seq cluster. e, Dot plot showing expression of myeloid genes. f, Flow cytometry of Zbtb46 (GFP) expression in ILC3 subsets from mLN of 3-week-old Zbtb46GFPRorgtcreR26lsl-tdTomato mice. Representative of n = 4 mice from two independent experiments. g-h, CellTypist derived cell labels for cell clusters from Fig. 2g, using a broad classification (g) or finer cell type annotation (h). i, Correspondence between cell labels for scATAC-seq and scRNA-seq./p>

1.5, adj. P < 0.01) between Aire+ mTEC and TC I. i, Bar graph showing log-normalized expression of Ptprc and Rorc genes in Aire+ mTECs and TCs. j, Flow cytometry of RORγt expression in Aire+ mTECs isolated from P18 RorcVenus-creERT2AireGFP mice. k, Heatmap reporting scaled expression values for top differentially expressed genes (FC > 1.5, adj. P < 0.01) between indicated SS2 clusters (f). Data in a,b are representative of > 3 independent experiments. Data in j representative of n = 5 mice from two independent experiments./p>